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Power Green qPCR Mix (P2101-P2102-P2103-P2104)

促銷: 480.00~25200.00
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P2101(1ml) P2102(1mlx5) P2103(1mlx10) P2104(1mlx50) P2105(1ml×100)

Power Green qPCR Mix

Cat. #P2101P2102P2103P2104P2105

產品簡介

Power Green qPCR Mix2X濃縮的實時定量PCR預混液,使用時只需加入模板和引物即可進行反應。本品中的DNA聚合酶是新一代化學修飾的Hotstart Taq DNA聚合酶,在室溫下活性被完全抑制,從而可以在室溫下配置反應液。同時,本品含有基于核酸適配子(Aptamer)的抑制劑,能夠與DNA聚合酶可逆結合。當溫度低于45℃時與聚合酶結合抑制其活性,當溫度達到94℃時與聚合酶分離激活酶活性,從而可以減少引物二聚體和其他次級產物對反應的干擾。采用這種雙重熱啟動機制可以顯著提高定量PCR的特異性。本品可與常見定量PCR儀完美兼容,如ABIRocheBio-Rad等。

產品組成

Component

P2101

P2102

P2103

P2104

P2105

2X Power Green qPCR Mixa

1 ml

1 ml × 5

1 ml × 10

1 ml × 50

1 ml × 100

超純水

1 ml

1 ml × 5

-

-

-

a.包含SYBR? Green IHotstart Taq DNA聚合酶,AptamerdNTP及反應緩沖液等。

保存條件

Power Green qPCR Mix -20℃避光保存2年,4℃避光可短期保存。

質量控制

純度檢測:經質量檢測,產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測:經不同來源的模板和引物檢測,產品具有優秀的特異性、靈敏性及可重復性等。

應用舉例

1. 配制反應體系

Component

Volume

Final   concentration

DNA template[1]

0.5-2 μl

1-4 μl

Variable

Forward primer (10 μM)[2]

0.2 μl

0.4 μl

0.2 μM

Reverse primer (10 μM)

0.2 μl

0.4 μl

0.2 μM

2X Power Green qPCR Mix[3]

5 μl

10 μl

1X

ddH2O

Variable

Variable

-

Total volume[4]

10 μl

20 μl

-

[1] DNA模板建議用量(10-20 μl體系):1-10 ng cDNA,或10-100 ng gDNA。加樣體積不宜過小,以免造成較大的誤差,但是cDNA的量不宜超過總體積的1/10。因此模板建議濃度(加樣前):cDNA 1-10 ng/μlgDNA 10-100 ng/μl

[2] 引物終濃度建議范圍:0.2-0.6 μM。特異性差時可降低濃度,效率低時可提高濃度。

[3] 如果熔解曲線出現雜峰,可以減少Mix用量至8 μl20 μl體系);如果對痕量模板的檢出率較低,可以增加Mix用量至12 μl20 μl體系)。

[4] 建議總體積不小于10 μl,以免造成較大的加樣誤差。具體體積范圍參考儀器說明。

注意:對于某些固定型號的儀器,需要添加ROX才能精確測定Ct值。ROX會給熔解曲線分析造成一定的背景干擾。因此,為了避免ROX的雜峰背景干擾,在應用軟件的“Passive Reference Dye”中不要選擇檢測ROX熒光值選項,然后再進行數據的收集與分析。由于ROX的使用體積較小,建議將ROX提前與qPCR Mix混勻使用。ROX用量參照具體儀器說明,下表僅供參考。

Instruments

ROX (100X)

ABI PRISM 7000/ PRISM   7700/ 7300/ 7900HT/ Step One/ Step One Plus/ GeneAmp 5700

1-2% (High ROX)

ABI 7500/ 7500   Fast/ ViiA 7/ QuantStudio 6/7/12K Flex; Agilent Stratagene Mx3000P/ Mx3005P/   Mx4000

0.2% (Low ROX)

Bio-Rad CFX96/   CFX384/ iQ/ iQ5; MJ Research Opticon 2/ Chromo 4; Roche LightCycler 480/ 96;   Corbett Rotor Gene G/ Q/ 3000/ 6000; Thermo PikoReal 96; Eppendorf   MasterCycler ep realplex; Cepheid Smart Cycler

No ROX

2. 設定反應程序進行qPCR反應

注:本品含有熱啟動酶,在60℃時會抑制酶活性,因此不建議使用兩步法,推薦使用經典三步法或極速三步法。

經典三步法程序如下:

Stage

Temperature

Time

Cycle

Initial denaturation

94

3 min

1

Denaturation

94

15 sec

40

Annealing

55-65[1]

15 sec

Extension

72

20 sec

Dissociation/Melting curve analysisoptional[3]

本品可用極速三步法快速完成反應,程序如下:

Stage

Temperature

Time

Cycle

Initial denaturation

94℃

3 min

1

Denaturation

94℃

5 sec

40

Annealing

55-65℃[1]

5 sec

Extension

72℃

5-10 sec[2]

Dissociation/Melting curve analysisoptional[3]

[1] 最適退火溫度需要摸索。退火溫度一般設定為所用引物的Tm-5℃,若低于55℃,則以Tm值為退火溫度,一般不低于55℃

[2] 150 bp以內的擴增子可設置為5 sec150-300 bp的擴增子可設置為10 sec300 bp以上的擴增子可適當延長時間。

[3] 不同儀器熔解曲線采集程序不同,一般按儀器默認熔解曲線采集程序即可。可在延伸(三步法)或退火延伸(兩步法)階段采集信號,也可在反應結束后72 hrs之內采集(避光低溫保存)。

3. 分析結果

觀察擴增曲線;調整基線,計算Ct值;觀察熔解曲線檢測特異性;進行相對或絕對定量。

注意事項

? 使用前Mix需要完全解凍,充分混勻。盡量避免多次反復凍融。短期使用可避光保存于4℃

? 將(n+x)份反應液混勻后再分注到n個單管中,可降低加樣誤差。(n為重復次數,x為損耗量,一般為n1/10

? ABI的定量儀器大部分需要ROX校正管間差異,Bio-Rad的定量儀器不需要ROX校正。具體儀器請參照其使用說明。

? 輕輕混勻反應液,避免產生氣泡,氣泡會干擾熒光檢測。可瞬時離心去除氣泡。

? 引物的特異性、用量以及退火溫度是影響實驗結果的重要因素。務必設計特異性好的引物,隨實驗結果適當調整引物用量(0.05-0.9 μM——特異性較差時減少引物用量,或以3℃為增量提高退火溫度,擴增效率較低時增加引物用量。

? DNA模板的量應小于500 ng/反應,過高的模板量會引起非特異性擴增。應根據模板類型與基因表達量適當調整用量。

? 熔解曲線的采集不是必須的,初次使用的引物建議進行熔解曲線采集。熔解曲線可以看出產物的特異性。產物特異性不好的原因有:引物特異性低;退火溫度設置偏低;引物/模板濃度偏高;等。同時,建議通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的特異性。

相關產品

名稱

貨號

規格

PCR Mix

P2011/P2012/P2013/P2014/P2015

1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

Power Green   qPCR Mix

P2101/P2102/P2103/P2104/P2105

1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

1kb ladder

M1181/M1182

50/250

DSTM5000

M1111/M1112

60/300

高純度質粒小提試劑盒

N1011/N1012/N1013

50/100/200

通用RNA提取試劑盒

R1051

50

基因組DNA快速提取試劑盒

N1111/N1112

50/100

DNA凝膠回收試劑盒

N1071/N1072/N1073

50/100/200

RT-PCR Kit

R1011/R1012

20/100

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