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TRAzol(R1021-R1022)

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R1021(20次) R1022(100次)

TRAzol

產品說明

TRAzol可以從動物組織、植物材料、各種微生物以及培養細胞等組織材料中提取總RNA。樣品在TRAzol中能夠充分被裂解,在加入氯仿離心后,溶液會形成上清層、中間層和有機層(下層),RNA分布在上清層中,收集上清層后,經異丙醇沉淀便可以回收得到總RNA。經本制品提取的總RNA純度高,基本不含蛋白質及基因組DNA,提取的RNA可以直接用于Northern雜交、斑點雜交、mRNA純化、體外翻譯、RNA分解酶的保護分析、RT-PCR、構建cDNA文庫等各種分子生物學實驗。

 

產品組分

貨號

R102120次)

R1022100次)

TRAzol

20 ml

100 ml

說明書

1

1

需要自備氯仿、異丙醇、RNase-free 75%乙醇、DEPC處理水(R2041/R2042

 

保存條件

室溫運輸,2-8℃避光保存。

 

注意事項

●   TRAzol具有腐蝕性,操作過程中應做好防護,避免直接接觸皮膚或吸入口鼻。沾染后應立即用大量清水沖洗,必要時請就醫處理。

●   嚴防操作環境、使用的容器、耗材和試劑的RNase污染。操作過程中勤換手套。

●   根據起始材料量的不同使用不同體積的溶液(見下表)。過多或過少的使用量都可能影響RNA的質量或產量。若起始材料量很少,RNA預計產量很低,在異丙醇沉淀時,可加入20 mg/ml肝糖原溶液0.5-1 μl促進RNA沉淀。

●   不同起始材料試劑用量及TRAzol用量。

樣品用量

TRAzol的用量

10cm2的貼壁培養細胞

1 ml

107的懸浮培養細胞

1-2 ml

100 μl的白細胞

2 ml

50-100 mg的普通組織樣品

1 ml

50-100 mg的特殊組織樣品(肝、脾、骨及軟骨等)

2 ml

15-30 mg的植物材料(多糖和多酚含量不高的)

1 ml

●   使用本產品提取的RNA一般不含有DNA污染。在極少數情況下(與組織pH值等相關),如果有DNA污染而又必須去除,則可以用RNase-freeDNase處理樣品。

●   防止DNA污染方法:a. 減少樣本起始用量,如將100 mg的植物組織減少為50 mg,將30 mg的動物組織減少為10 mg

                      b. 在加入TRAzol之后加入5-10 ul 3M NaAc(pH5.2)

●   請嚴格遵照操作步驟操作。

●   有關RNA的吸光度說明如下:

260 nm320 nm230 nm280 nm下的吸光度分別代表了核酸、背景(溶液渾濁度)、鹽濃度和蛋白質等有機物的吸光度值。OD260/OD280R)體現了RNA中的蛋白質等有機物的污染程度,質量較好的RNAR值應在1.8-2.0之間,當R<1.8時,溶液中的蛋白質等有機物的污染比較明顯;當R>2.2時,說明RNA已經被水解成了單核苷酸。在對核酸進行吸光度檢測時,需要注意稀釋液應使用TE Buffer

●   RNA濃度=OD260-OD320×稀釋倍數×0.04 μg/μl

 

 

 

操作步驟

1.      實驗樣品的研磨和勻漿

A. 貼壁培養細胞

倒出培養液,用1X PBS清洗一次,每10 cm2生長的培養細胞中加入1mlTRAzol,水平放置片刻,使裂解液均勻分布于細胞表面并裂解細胞,然后使用移液槍吹打細胞使其脫落(對于貼壁牢固的培養細胞可用細胞刮勺剝離細胞)。將內含細胞的裂解液轉移至離心管中,用移液槍反復吹吸直至裂解液中無明顯沉淀。室溫靜置5 min

B. 懸浮培養細胞

將懸浮培養細胞連同培養液一起倒入離心管中,8,000 rpm4℃離心2 min,棄上清,向每107個細胞中加入l-2 mlTRAzol。用移液槍反復吹吸直至裂解液中無明顯沉淀,室溫靜置5 min

C. 動物組織、植物材料樣品

將超低溫凍結的RNA提取樣品稱量后迅速轉移至用液氮預冷的研缽中,用研杵研磨組織,其間不斷加入液氮,直至研磨成粉末狀(無明顯的可見顆粒,如果沒有研磨徹底會影響RNA的收率和質量)。對于普通的RNA提取樣品,可以向研缽中加入適量的TRAzol,將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋,然后室溫靜置,直至樣品完全融化,再用研杵繼續研磨至裂解液呈透明狀。對于特殊樣品,如肝、脾、骨及軟骨等,可以將研磨成粉末狀的樣品加入到含有適量的TRAzol的勻漿管中,把勻漿管置于冰浴中進行勻漿,直至勻漿液呈無顆粒透明狀。將勻漿液轉移至離心管中,室溫靜置5 min12,000 rpm 4 ℃離心5 min,小心吸取上清液,移入新的離心管中(切勿吸取沉淀)。

 

2.      Total RNA的提取

向上述步驟中的勻漿裂解液中加入氯仿(TRAzol1/5體積量),蓋緊離心管蓋,用力振蕩(氯仿沸點低、易揮發,振蕩時應小心離心管蓋突然彈開)。待充分乳化溶液呈乳白狀(無分相現象)后,再室溫靜置2 min

2  12,000 rpm 4 ℃離心10 min

從離心機中小心取出離心管,此時勻漿液分為三層,即:無色的上清液、中間的白色層及帶有顏色的下層有機相,吸取上清液轉移至另一新的離心管中(切忌吸出白色中間層)。

(如樣品含有較多多糖多酚,請增加以下步驟:在上清液中加入0.2X上清液體積的5 M NaCl1X上清液體積的酚/氯仿(1:1),混勻,12000 rpm離心5-10 min ,取上清液加入等體積氯仿,混勻,12000 rpm 離心 5-10 min,至第4步。)

向上清中加入等體積的異丙醇,上下顛倒離心管充分混勻后,在15-30℃下靜置10 min

5  12,000 rpm 4℃離心10 min。一般在離心后,試管底部會出現沉淀。

 

3.      RNA沉淀的清洗

小心棄去上清,緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇1 ml(切勿觸及沉淀),輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁,12,000 rpm4 ℃離心2 min后小心棄去乙醇(為了更好地控制RNA中的鹽離子含量,應盡量除凈乙醇),重復洗滌一次。

 

4.      RNA的溶解

室溫干燥沉淀2-5 min(不可以離心或加熱干燥,否則RNA將會很難溶解),加入適量的RNase-free水溶解沉淀,必要時可用移液槍輕輕吹打沉淀,待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。



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